Flowcytometri er en cytologisk forskningsmetode, der bruges til dybdegående analyse af celler. Dens fordel er, at den giver dig mulighed for at studere hver celle individuelt. Denne type analyse hjælper med at evaluere flere parametre i hundredvis af celler i løbet af få sekunder. Som et resultat heraf betragtes cytofluorimetri som en af de hurtigste og mest nøjagtige analysemetoder, der i øjeblikket er tilgængelige for videnskabsmænd og klinikere.
Princip
Flowcytometriprincippet er baseret på måling af lysspredning og luminescens (fluorescens) af celler. Cellesuspensionen ledes som en strøm med høj hastighed gennem cytometercellen, hvor den bestråles med laser. Der udføres også den såkaldte hydrodynamiske fokusering. Dens mekanisme er, at strømmen fra cellen med de undersøgte partikler ved udløbet strømmer ind i den eksterne stråle, som har en højere hastighed. Som følge heraf er partikler justeret i en ordnet kæde.
Førceller er mærket med specielle fluorescerende farvestoffer (fluorokromer). Takket være dem, laserstrålenfremkalder en sekundær glød. De modtagne lyssignaler registreres af detektorer. Efterfølgende behandles oplysningerne ved hjælp af softwarealgoritmer, der giver dig mulighed for at tælle individuelle cellepopulationer, der adskiller sig i nogle kriterier.
Forskning med konventionel mikroskopi formår ofte ikke at skelne mellem forskellige celler, fordi de ser ens ud. Cytofluorimetri kan give andre data (DNA-strukturintegritet), analysere proteinekspression, celleoverlevelse.
Da excitation af fluorokromer kræver lysstråler med forskellige bølgelængder, samt forskellige typer detektorer, er moderne installationer udstyret med flere detektionskanaler (fra 4 til 30). Antallet af laseremittere kan være fra 1 til 7. Mere komplekse enheder tillader multiparameterundersøgelser af flere egenskaber af partikler på én gang.
Fordele og ulemper
Fordelene ved flowcytometri omfatter:
- høj behandlingshastighed (registrering af op til 30 tusind begivenheder på 1 sekund);
- mulighed for at studere et stort antal celler (op til 100 millioner i en prøve);
- Kvantificering af intensiteten af fluorescerende lys;
- analyse af hver celle;
- samtidig undersøgelse af heterogene processer;
- automatisk adskillelse af data efter cellepopulationer;
- kvalitetsvisualisering af resultater.
En anden funktion ved denne teknologi er detden analyserede partikel kan farves med flere fluorescerende opløsninger. Takket være dette sker der en undersøgelse med flere parametre.
Ulemperne omfatter kompleksiteten af det tekniske udstyr og behovet for speciel prøveforberedelse.
Cytometre
De første enheder af denne type dukkede op allerede i 1968 i Tyskland, men de blev udbredt meget senere. I øjeblikket kan alle enheder, der fungerer ved flowcytometrimetoden, opdeles i 2 typer:
- enheder, der måler fluorescerende stråling (to eller flere bølgelængder), 10° og 90° lysspredning (lav vinkel og sidespredningsdetektor);
- enheder, der ud over at måle flere cellulære parametre automatisk sorterer i grupper i henhold til disse kriterier.
Forward scatter-detektoren er designet til at bestemme størrelsen af cellen, og side scatter-enheden giver dig mulighed for at få information om tilstedeværelsen af intracellulære granula, volumenforholdet mellem cytoplasmaet og kernen.
Klassiske cytometre, i modsætning til lysmikroskoper, tillader ikke at få et billede af en celle. Men i de senere år er der udviklet kombinerede enheder, der er i stand til at kombinere evnerne fra et mikroskop og et cytofluorimeter. De vil blive diskuteret nedenfor.
Billedbehandlingscytometre
For instrumenter, der bruges i klassisk flowcytometri,et træk er karakteristisk: hvis sjældne hændelser er registreret i populationen af analyserede celler, så er der ingen måde at vurdere, hvad deres essens er. Disse partikler kan enten være rester af døde celler eller en sjælden gruppe af dem. I konventionelt udstyr er sådanne data udelukket fra den generelle strøm af begivenheder, men det er dem, der kan være af særlig værdi for videnskabelig og klinisk analyse.
Den nye generation af billeddannende flowcytometre giver dig mulighed for at tage et billede af hver celle, der passerer i flowet gennem detektorzonen. Det er nemt at se det ved at klikke på det tilsvarende område af diagrammet, som vises på computerskærmen.
Anvendelsesområder
Flowcytometri er en universel metode, der bruges inden for mange områder inden for medicin og videnskab:
- immunologi;
- onkologi;
- transplantologi (transplantation af rød knoglemarv, stamceller);
- hæmatologi;
- toksikologi;
- biokemi (måling af surhedsgrad inde i cellen, undersøgelse af andre parametre);
- farmakologi (oprettelse af nye lægemidler);
- mikrobiologi;
- parasitologi og virologi;
- oceanologi (studiet af fytoplankton for at vurdere tilstanden af vandområder og andre opgaver);
- nanoteknologi og mikropartikelanalyse.
Immunologi
Det menneskelige immunsystem består af en lang række celler. Flowcytometri i immunologi gør det muligt at evaluere deres struktur og funktioner, det vil sige at udføre morfofunktionelleanalyse.
Sådan forskning hjælper med at forstå immunitetens komplekse natur. Cellefænotyper ændres som følge af aktivering af antigener, udvikling af patologier og andre faktorer. Cytofluorometri kan adskille subpopulationer af immunceller i en kompleks blanding og evaluere alle deres ændringer over tid.
Onkologi
En af de vigtigste opgaver inden for onkologi er differentiering af celler efter deres type. Princippet for analyse ved flowcytometri i onkohæmatologi er baseret på følgende fænomen: når en prøve behandles med et specielt fluorescerende farvestof, binder det til cytoplasmatiske proteiner. Efter deling i aktivt prolifererende celler falder dets indhold med det halve. Følgelig falder intensiteten af celleluminescens dobbelt.
Der er andre måder at opdage prolifererende celler på:
- brug af DNA-bindende farvestoffer (propidiumiodid);
- brug af mærket uracil;
- registrering af et øget ekspressionsniveau af cyclinproteiner, som er involveret i reguleringen af cellecyklussen.
