PCR, eller polymerasekædereaktion, er en sofistikeret laboratorieteknik, der er meget udbredt inden for medicin og andre videnskabelige områder. PCR-diagnostik blev på et tidspunkt et reelt gennembrud inden for videnskaben.
Description
Kvantitativ PCR er en type re altids-PCR.
Dette forstås som en variant af PCR, hvor kinetikken af reaktionen konstant registreres, hvilket gør det muligt kvalitativt at vurdere indholdet af specifikke DNA-nukleotidsekvenser i en kompleks molekylær blanding.
Kvantitativ PCR-metode vil blive diskuteret mere detaljeret nedenfor.
essensen af analysen
Kulturelle og serologiske metoder bruges især ofte til at diagnosticere infektioner. Under den første bestemmes antistoffer mod et infektiøst patogen i blodserumet. I den anden bruges biologisk materiale taget fra en syg person til at så et specifikt medium, der er gunstigt for væksten af patogenkolonier. Diagnostik i beggesagen kan vare dage eller uger.
PCR-undersøgelse kan udføres med forskellige biologiske materialer, som fås fra en syg person. Blod og andre patologiske, fysiologiske og biologiske medier og væsker fungerer som prøver. Du kan lave PCR afføring eller urin.
Atypiske og virale infektioner diagnosticeres oftest ved kvantitativ PCR, da de muligvis ikke er lette at diagnosticere på grund af den specifikke karakter af den patologiske proces, de fremkalder. For at bestemme sådanne infektioner tager det tid, hvor der begynder at blive produceret antistoffer i kroppen, bestemt ved serologiske metoder. Men dette er uacceptabelt i nogle tilfælde.
Udførelsesmetode
PCR-metode - laboratoriepåvisning af infektion i prøver isoleret fra patienten (in vitro).
For at udføre en polymerasekædereaktion kræves der et sæt specielle reagenser.
Testmaterialet indføres i reagensglas med reagenser. Reagensglassene placeres i et specielt apparat - en PCR-forstærker, som er designet til at amplificere (øge antallet) af de ønskede RNA- eller DNA-fragmenter, PCR-forstærkeren fungerer i en cyklisk tilstand. I en hvilken som helst cyklus, hvis prøverne indeholder RNA- eller DNA-sekvensen af patogenet, akkumuleres flere og flere kopier af partiklerne af disse nukleinsyrer i opløsningen. Du kan bestemme tilstedeværelsen af patogenet og dets mængde i prøverne.
Typer af PCR
Kvalitativ analyse ved PCR giver dig mulighed for at få følgende resultat:
- negativ, når patogenet af interesse ikke findes i prøverne;
- positiv, hvis der findes sekvenser i prøverne, som er karakteristiske for et bestemt patogen.
Med et positivt PCR-resultat kan vi tale med 95 % nøjagtighed om tilstedeværelsen af en diagnosticeret infektion. Samtidig når nøjagtigheden af PCR-sæt, der bruges til diagnostiske formål, op på 100%.
Norm alt bestemmes 5 % af de forkerte resultater af den menneskelige faktor. For eksempel kan overtrædelser af teknikken til analyse og opbevaring af reagenser reducere undersøgelsens nøjagtighed betydeligt.
Kvantitativ PCR definerer begrebet viral load. Det er muligt at bestemme, hvor mange sæt patogen-DNA der var i prøverne taget fra patienten.
Sværhedsgraden af infektionen er direkte proportional med stigningen i deres antal. Du kan også bestemme succesen med terapi for at reducere virusmængden.
Indsendelse til PCR-biomateriale
Kvantitativ PCR udføres i klinikken, primært om morgenen. Ved et besøg hos lægen vil patienten få at vide, hvad der skal tages: afskrabning, udstrygninger, urin eller blod. PCR kan påvise patogener uanset niveauet af kontaminering af materialet.
For en positiv analyse kræves i teorien kun tilstedeværelsen af ét patogen i prøverne. I praksis forsøger de at skabe endnu mere gunstige forhold. Der er nogle anbefalinger til dette:
- hvis de tager en afskrabning eller vatpind fra kønsorganerneorganer, skal du afstå fra intimt samleje tre dage før undersøgelsen;
- du kan ikke skylle med antibakterielle lægemidler eller vaske dig selv før analysen;
- tre timer før du tager en udstrygning fra urinrøret, skal du være tålmodig og ikke tømme dine tarme.
Følg ikke disse regler, når du donerer blod.
Hvordan fortolkes resultaterne af kvantitativ PCR-analyse?
Kvantitativ evaluering af de opnåede resultater
I en række kliniske situationer opstår problemet med behandlingens effektivitet og/eller dynamikken i den patologiske proces. Sådanne spørgsmål er især relevante, når man undersøger personer med kroniske infektioner (humant immundefektvirus, hepatitis B og C). Ved diagnosticering er de baseret på det faktum, at akkumuleringen af amplikoner (PCR-produkter) er proportional med tilstedeværelsen af kopier af det ønskede gen i den analyserede prøve.
Under hensyntagen til resultaterne af kvantitativ PCR udføres naturligvis ved gelelektroforese med undersøgelse af intensiteten af specielle PCR-signaler. Ligeledes er en forudsætning for en korrekt kvantitativ vurdering af de opnåede resultater positive pålidelige kontrolprøver indeholdende et kendt antal kopier af det ønskede gen (f.eks. tusinde kopier af hepatitis C-genet for én PCR-reaktion). Adskillige serielle fortyndinger af den kvantitative kontrol gør det muligt at generere kalibreringskurver og bruges til at evaluere indholdet af kliniske genokopier i kliniske prøver.
I definitionen af kvantitativ PCR har en nøglepræstation været skabelsenfluorescerende DNA-prober, der tilsættes til reaktionsblandingen samtidigt med simple primere og giver dig mulighed for at spore PCR-processen i tid, det vil sige real-time PCR.
TaqMan-metoden refererer til syntesen af fluorescerende DNA-prober, der er specifikke for den midterste del af amplikonet og har to mærker i enderne. En af dem er en fluorescerende etiket, den anden er et quencher-molekyle til denne fluorescens.
En speciel enhed, som er en hybrid af et fluorimeter og en termoblok-forstærker, foretager konstante målinger af fluorescens i hvert reagensglas (real-time PCR princip). Efter 20-40 PCR-cyklusser opnås individuelle kurver for hver prøve. Antallet af kopier af det ønskede gen, der er indeholdt i testprøven, kan beregnes ud fra kalibreringskurver med kontrolprøver.
Et vigtigt træk ved implementeringen af PCR ved fluorescerende metode er også, at der ikke er behov for at åbne rør med en PCR-blanding, når resultaterne tages i betragtning. Dette reducerer muligheden for rumkontamination med forstærkningsprodukter, og der er ikke behov for at afsætte særlige arbejdsområder til elektroforese.
Hvad viser en kvantitativ PCR-transskription?
Hvad bliver opdaget?
Ved en metode som kvantitativ PCR findes kvalitative ændringer i gener: insertioner, deletioner og punktmutationer. Men med nogle arvelige lidelser opstår de tilsvarende symptomer som reaktion på en ændring i indholdet af visse gener.
TakKvantitativ analyse giver et numerisk resultat, oftest i IE/ml. Det betyder, at der i en milliliter af testprøven blev fundet et vist antal kopier af RNA eller DNA fra patogenet, målt i internationale enheder.
Afhængigt af størrelsen diagnosticeres infektionens sværhedsgrad. Blod testes norm alt for at bestemme viral belastning, da vira bevæger sig frit i blodet under sygdom.
Funktioner
Kvantitativ PCR i en blodprøve har to funktioner.
- Analysen udføres i nærværelse af primere eller deoxyribonukleosidtrifosfater, som er mærket med et fluorescerende eller radioaktivt mærke for nøjagtigt at bestemme indholdet af det dannede PCR-produkt.
- Afslut reaktionen tidligt i PCR-processen, før der vises for mange PCR-produkter. Dette skyldes det faktum, at i det sidste trin af mætning, når der er mange PCR-produkter, fungerer både enzymet selv og substraterne som de begrænsende led i denne reaktion. Afslutningen af den næste PCR-cyklus under sådanne forhold er ikke længere karakteriseret ved en fordobling af antallet af PCR-produkter, ubetydelige kvantitative forskelle mellem forskellige prøver udjævnes, som er ret klart defineret i de tidlige stadier efter at have passeret gennem en række reaktionscyklusser.
Omkostninger til PCR-diagnostik
PCR-forskning har en omkostning, som afhænger af, hvilken slags infektion der testes, af analysemetoden og testmaterialet. For at bestemme en infektion, bliver du nødt til at give inden for200-800 rubler. Et gebyr for at tage biomateriale tillægges også - cirka 400 rubler.
