Kromatografi er en af metoderne til at adskille stoffer. Det bruges til efterfølgende kvalitativ og kvantitativ analyse af mikropartiklers fysiske og kemiske egenskaber. En variation af denne teknologi er affinitetskromatografi. Ideen om at differentiere proteinforbindelser ved hjælp af egenskaben molekylær affinitet har været kendt i videnskaben i flere årtier. Det har dog først modtaget sin udvikling i de senere år, efter introduktionen af meget porøse hydrofile materialer, der anvendes som en matrix. Denne metode gør det muligt at løse både analytiske problemer (adskillelse af stoffer og deres identifikation) og præparative problemer (oprensning, koncentration).
Essence
Affinitetskromatografi (fra det latinske ord affinis - "tilstødende", "beslægtet") er baseret på affinitetsinteraktioner, som er dannelsen af meget specifikke bindinger mellem et spacer-molekyle (ligand eller affinant) og et målmolekyle. Disse mekanismer er udbredte i naturen (forbindelse af mediatorer eller hormoner og receptorer, antistoffer ogantigener, hybridisering af polynukleotider og andre typer processer). Inden for medicin er affinitetskromatografi blevet brugt til praktiske formål siden 1951
Komponenterne er adskilt som følger:
- arbejdsopløsning, der indeholder stoffet, der skal isoleres, ledes gennem sorbenten;
- ligand aflejret på sorbentmatrixen bevarer dette stof;
- det er koncentreret (akkumulering);
- ekstraktion af det isolerede stof fra sorbenten ved vask med et opløsningsmiddel.
Denne metode giver dig mulighed for at isolere hele celler. Forskellen fra traditionel sorptionskromatografi er, at der er en stærk biospecifik binding af den isolerede komponent til sorbenten, som er karakteriseret ved høj selektivitet.
Adsorbenter
Følgende stoffer bruges som adsorbenter:
- Gelforbindelser baseret på agarose, et polysaccharid opnået fra agar. De mest almindeligt anvendte er 3 varianter: Sepharose 4B, CL (tværbundet agarose) og affi-gel. Sidstnævnte sammensætning er en modificeret gel af agarose og polyacrylamid. Den har større biologisk inertitet, høj kemisk og termisk modstand.
- Silica (silicagel).
- Glas.
- Organiske polymerer.
For at fjerne mekaniske forhindringer under ligandkontakt bruges yderligere stoffer til at adskille den fra bæreren (peptider, diaminer, polyaminer, oligosaccharider).
Udstyr
Affinitetskromatografiudstyr inkluderer følgende hovedenheder:
- lagertanke til den mobile fase (eluent);
- højtrykspumper til medium forsyning (oftest frem- og tilbagegående);
- filter til rengøring af eluenter fra støv;
- doseringsenhed;
- kromatografisk kolonne til blandingsseparation;
- detektor til detektering af adskilte komponenter, der forlader kolonnen;
- chromatogramoptagere og mikroprocessorenhed (computer).
For at reducere mængden af opløst luft ledes helium først gennem den mobile fase. For at ændre koncentrationen af eluenten er der installeret flere pumper styret af programmeringsenheden. Kromatografiske søjler er lavet af rustfrit stål (for øgede krav til korrosionsbestandighed), glas (universel mulighed) eller akryl. Til forberedelsesformål kan deres diameter variere fra 2 til 70 cm. Ved analytisk kromatografi anvendes mikrosøjler Ø10-150 µm.
For at øge detektorernes følsomhed indføres reagenser i blandingen, som bidrager til dannelsen af stoffer, der absorberer flere stråler i det ultraviolette eller synlige område af spektret.
Metode
Der er 2 hovedtyper af væskeaffinitetskromatografi:
- Søjle, hvor søjlen er fyldt med en stationær fase, og en blanding ledes gennem den med en strømningeluent. Adskillelse kan forekomme under tryk eller under tyngdekraften.
- Tyndt lag. Eluenten bevæger sig langs det flade adsorberende lag under påvirkning af kapillarkræfter. Adsorbenten påføres en glasplade, keramik eller kvartsstav, metalfolie.
De vigtigste faser af arbejdet omfatter:
- forberedelse af adsorbenten, fiksering af liganden på bæreren;
- tilførsel af separationsblandingen til den kromatografiske kolonne;
- mobilfaseindlæsning, komponentbinding med ligand;
- faseudskiftning for at isolere det bundne stof.
Destination
Affinitetskromatografi bruges til at isolere følgende typer stoffer (den anvendte ligandtype er angivet i parentes):
- analoger af enzymatiske inhibitorer, substrater og cofaktorer (enzymer);
- bioorganiske stoffer med tegn på genetisk fremmedhed, vira og celler (antistoffer);
- kulhydrater med høj molekylvægt, monosaccharidpolymerer, glykoproteiner (lektiner);
- nukleære proteiner, nukleotidyltransferaser (nukleinsyrer);
- receptorer, transportproteiner (vitaminer, hormoner);
- proteiner, der interagerer med cellemembraner (celler).
Denne teknologi bruges også til at opnå immobiliserede enzymer, og binding af dem til cellulose muliggør produktion af immunosorbenter.
Chromatografi af DNA-bindende proteiner
Isolering af DNA-bindende proteiner udføres vhaheparin. Denne glycosaminoglycan er i stand til at binde en lang række molekyler. Affinitetskromatografi af proteiner fra denne gruppe bruges til at isolere stoffer som:
- faktorer for initiering og forlængelse af translation (syntese af nukleinsyremolekyler og proteiner);
- restrictases (enzymer, der genkender visse sekvenser i dobbeltstrenget DNA);
- DNA-ligaser og polymeraser (enzymer, der katalyserer sammenføjningen af to molekyler for at danne en ny kemisk binding og er involveret i DNA-replikation);
- serinproteasehæmmere, der spiller en vigtig rolle i immun- og inflammatoriske processer;
- vækstfaktorer: fibroblast, Schwann, endotel;
- proteiner af ekstracellulær matrix;
- hormonreceptorer;
- lipoproteiner.
Dignity
Denne metode er en af de mest specifikke til isolering af reaktive forbindelser (enzymer og større aggregater - vira). Det bruges dog ikke kun til at isolere biologisk aktive stoffer.
Detektion af antistoffer i små mængder, kvantitativ vurdering af polyadenylsyre, hurtig bestemmelse af molekylmasserne af dehydrogenaser, fjernelse af visse forurenende stoffer, undersøgelse af kinetikken for aktivering af den inaktive form af trypsin, menneskets molekylære struktur interferoner - dette er ikke hele listen over undersøgelser, hvor affinitet anvendes kromatografi. Brugen i klinikken skyldes dens fordele såsom:
- Effektiv rengøringsevneproteiner, polysaccharider, nukleinsyrer. De adskiller sig lidt i deres fysiske og kemiske egenskaber og mister aktivitet under hydrolyse, denaturering og andre former for behandling, der anvendes i andre metoder.
- Hastigheden af adskillelse af stoffer, den dynamiske karakter af processen.
- Intet behov for speciel enzymoprensning og isoenzymhomogenisering for at bestemme dissociationskonstanter.
- Kan adskille en lang række stoffer.
- Lavt forbrug af ligander.
- Mulighed for adskillelse af stoffer i store mængder.
- Reversibel proces med binding af biologiske makromolekyler.
Denne teknik kan kombineres med andre for at pålægge et ekstra felt (tyngdekraft, elektromagnetisk). Dette giver dig mulighed for at udvide de tekniske muligheder for kromatografi.
Enzymatisk teknik
Takket være denne metode begyndte den aktive udvikling af en ny gren af bioteknologi - enzymteknologi.
Affinitetskromatografi til enzymisolering har følgende fordele:
- indhentning af enzymer i store mængder som et resultat af kortere tid, som et resultat - deres reduktion i prisen;
- immobilisering af enzymer kan udvide omfanget af deres anvendelse i medicin og industri betydeligt;
- Forbindelsen af enzymer med en uopløselig fast støtte gør det muligt at studere mikromiljøets indflydelse og retningen af reaktioner, som spiller en vigtig rolle i naturlige og fysiologiske processer.
